本标准规定了食品中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2(以下简称AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2)的测定方法。第一法为同位素稀释液相色谱-串联质谱法,适用于AFTB1、AFTB2、AFTG1和AFTG2的测定。第二法为高效液相色谱-柱前衍生法,适用于AFTB1、AFTB2、AFT G1和AFT G2的测定。第三法为高效液相色谱-柱后衍生法,适用于AFTB1、AFTB2、AFT G1和AFT G2的测定。第四法为酶联免疫吸附筛查法,适用于AFTB1的测定。（点击图片查看标准详情）
第一法 同位素稀释液相色谱—串联质谱法
原理:试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2,用乙睛水溶液或甲醇-水溶液提取,提取液用含1%TritonX-100(或吐温-20)的磷酸盐缓冲溶液稀释后(必要时经黄曲霉毒素固相净化柱初步净化),通过免疫亲和柱净化和富集,净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离,串联质谱检测，同位素内标法定量。
| 乙腈 |
| CH3CN，色谱纯 |
| 甲醇 |
| CH3OH，色谱纯 |
| 水 |
| 为GB/T 6682规定的一级水 |
| 乙酸铵 |
| CH3COONH4，色谱纯 |
| 氯化钠 |
| NaCl，分析纯 |
| 冰箱 |
| -20℃ |
| 容量瓶 |
| 100 mL |
| 容量瓶 |
| 10 mL |
| 吐温-20 |
| C58H114O26 |
| 试剂瓶 |
| – |
| 黄曲霉毒素B1标准溶液 |
| AFTB1，10μg/mL |
| 黄曲霉素B1-13C17标准溶液 |
| 0.5μg/mL |
| 磷酸氢二钠 |
| Na2HPO4，分析纯 |
| 磷酸二氢钾 |
| KH2PO4，分析纯 |
| 氯化钾 |
| KCl，分析纯 |
| 盐酸 |
| HCl，分析纯 |
| TritonX-100 |
| [C14H22O(C2H4O)n]，或吐温-20,C58H114O26 |
| 黄曲霉毒素B1 |
| AFT B1，C17H12O6,CAS:1162-65-8，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素B2 |
| AFT B2，C17H14O6,CAS:7220-81-7，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素G1 |
| AFT G1,C17H12O7,CAS:1165-39-5，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素G2 |
| AFT G2，C17H14O7,CAS:7241-98-7，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉素B1-13C17 |
| 13C17-AFT B1，同位素内标,C17H12O6,CAS:157449-45-0，纯度≥98%,浓度为0.5μg/mL |
| 黄曲霉毒素B2-13C17 |
| 13C17-AFT B2,同位素内标,C17H14O6,CAS:157470-98-8，纯度≥98%,浓度为0.5μg/mL |
| 黄曲霉毒素G1-13C17 |
| 13C17-AFT G1，同位素内标,C17H12O7,CAS:157444-07-9，纯度≥98%,浓度为0.5μg/mL |
| 黄曲霉毒素G2-13C17 |
| 13C17-AFT G2,同位素内标,C17H14O7,CAS:157462-49-7，纯度≥98%,浓度为0.5μg/mL |
| 匀浆机 |
| – |
| 捣碎机 |
| 组织捣碎机 |
| 粉碎机 |
| 高速 |
| 振荡器 |
| 超声波/涡旋振荡器或摇床 |
| 天平 |
| 感量0.01g和0.00001g |
| 涡旋混匀器 |
| 涡旋混合器 |
| 均质器 |
| 高速,转速6500r/min~24000r/min |
| 离心机 |
| 转速≥6000r/min |
| 滤纸 |
| 玻璃纤维滤纸,快速、高载量、液体中颗粒保留1.6μm |
| 固相萃取装置 |
| 带真空泵 |
| 氮吹仪 |
| – |
| 液相色谱串联质谱仪 |
| 带电喷雾离子源 |
| 免疫亲和柱 |
| AFTB1柱容量≥200ng,AFTB1柱回收率≥80%,AFTG2的交叉反应率≥80%(验证方法参见附录B) |
| 固相萃取柱 |
| 黄曲霉毒素专用型，或功能相当的固相萃取柱，以下简称净化柱):对复杂基质样品测定时使用 |
| 过滤器 |
| 微孔滤头,带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用) |
| 样品筛 |
| 筛网，1mm~2mm试验筛孔径 |
| 酸度计 |
| pH计 |
| 离心管 |
| 50ml |
| 液相色谱柱 |
| C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm;填料粒径1.7μm),或相当者 |
| 注射器 |
| 150mL |
| 泵 |
| 真空泵 |
| 试管 |
| 10ml刻度 |
| 氮气 |
| – |
| 移液管 |
| 刻度 |
| 样品瓶 |
| 进样瓶 |
第二法 高效液相色谱—柱前衍生法
原理:试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液经黄曲霉毒素固相净化柱净化去除脂肪,蛋白质、色素及碳水化合物等干扰物质,净化液用三氟乙酸柱前衍生,液相色谐分离.荧光检测器检测.外标法定量。
| 水 |
| GB/T 6682 规定的一级水 |
| 甲醇 |
| CH3OH，色谱纯 |
| 乙腈 |
| CH3CN，色谱纯 |
| 冰箱 |
| -20℃ |
| 容量瓶 |
| 100ml |
| 容量瓶 |
| 10 mL |
| 试剂瓶 |
| – |
| 振荡器 |
| 涡旋振荡器 |
| 摇床 |
| – |
| 黄曲霉毒素B1标准溶液 |
| AFTB1 |
| 正己烷 |
| C6H14，色谱纯 |
| 三氟乙酸 |
| CF3COOH，分析纯 |
| 黄曲霉毒素B1 |
| AFT B1，C17H12O6,CAS:1162-65-8，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素B2 |
| AFT B2，C17H14O6,CAS:7220-81-7，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素G1 |
| AFT G1,C17H12O7,CAS:1165-39-5，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素G2 |
| AFT G2，C17H14O7,CAS:7241-98-7，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 匀浆机 |
| – |
| 粉碎机 |
| 高速 |
| 捣碎机 |
| 组织捣碎机 |
| 超声波清洗器 |
| 超声波/涡旋振荡器或摇床 |
| 离心管 |
| 50 mL |
| 天平 |
| 感量0.01g和0.00001g |
| 涡旋混匀器 |
| 涡旋混合器 |
| 均质器 |
| 高速均质器,转速6500r/min~24000r/min |
| 离心机 |
| 转速≥6000r/min |
| 滤纸 |
| 玻璃纤维滤纸,快速、高载量、液体中颗粒保留1.6μm |
| 氮吹仪 |
| – |
| 液相色谱仪 |
| 配荧光检测器 |
| 固相萃取柱 |
| 黄曲霉毒素专用型，以下简称净化柱,或相当者 |
| 过滤器 |
| 一次性微孔滤头,带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用) |
| 样品筛 |
| 筛网，1mm~2mm试验筛孔径 |
| 恒温箱 |
| – |
| 酸度计 |
| pH计 |
| 氮气 |
| – |
| 样品瓶 |
| 进样瓶 |
| 液相色谱柱 |
| C18柱(柱长150mm或250mm,柱内径4.6mm,填料粒径5.0μm),或相当者 |
第三法 高效液相色谱—柱后衍生法
原理:试样中的黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、黄曲霉毒素G1、黄曲霉毒素G2,用乙腈-水溶液或甲醇-水溶液的混合溶液提取,提取液经免疫亲和柱净化和富集,净化液浓缩、定容和过滤后经液相色谱分离,柱后衍生(碘或溴试剂衍生、光化学衍生.电化学衍生等),经荧光检测器检测,外标法定量.
| 甲醇 |
| CH3OH，色谱纯 |
| 乙腈 |
| CH3CN，色谱纯 |
| 硝酸 |
| 浓硝酸,电化学衍生剂,HNO3 |
| 滤膜 |
| 0.45 um |
| 氯化钠 |
| NaCl，分析纯 |
| 磷酸氢二钠 |
| Na2HPO4，分析纯 |
| 磷酸二氢钾 |
| KH2PO4，分析纯 |
| 氯化钾 |
| KCl，分析纯 |
| 盐酸 |
| HCl，分析纯 |
| TritonX-100 |
| [C14H22O(C2H4O)n](或吐温-20,C58H114O26) |
| 碘 |
| I2，分析纯 |
| 三溴化吡啶 |
| 溴衍生使用试剂,C5H6Br3N2 |
| 溴化钾 |
| 电化学衍生使用试剂,KBr |
| 水 |
| 为GB/T 6682规定的一级水 |
| 黄曲霉毒素B1 |
| AFT B1，C17H12O6,CAS:1162-65-8，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素B2 |
| AFT B2，C17H14O6,CAS:7220-81-7，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素G1 |
| AFT G1,C17H12O7,CAS:1165-39-5，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 黄曲霉毒素G2 |
| AFT G2，C17H14O7,CAS:7241-98-7，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 冰箱 |
| -20℃ |
| 容量瓶 |
| 100 mL |
| 容量瓶 |
| 10 mL |
| 振荡器 |
| 涡旋振荡器 |
| 摇床 |
| – |
| 匀浆机 |
| – |
| 粉碎机 |
| 高速 |
| 捣碎机 |
| 组织捣碎机 |
| 超声波清洗器 |
| – |
| 天平 |
| 感量0.01g和0.00001g |
| 涡旋混匀器 |
| 涡旋混合器 |
| 均质器 |
| 高速,转速6500r/min~24000r/min |
| 离心机 |
| 转速≥6000r/min |
| 滤纸 |
| 玻璃纤维滤纸,快速、高载量、液体中颗粒保留1.6μm |
| 固相萃取装置 |
| 带真空泵 |
| 氮吹仪 |
| – |
| 液相色谱仪 |
| 配荧光检测器(带一般体积流动池或者大体积流通池) |
| 柱后衍生装置 |
| 光化学柱后衍生器,适用于光化学柱后衍生法 |
| 柱后衍生装置 |
| 溶剂柱后衍生装置,适用于碘或溴试剂衍生法 |
| 柱后衍生装置 |
| 电化学柱后衍生器,适用于电化学柱后衍生法 |
| 免疫亲和柱 |
| AFTB1柱容量≥200ng,AFTB1柱回收率≥80%,AFTG2的交叉反应率≥80% |
| 固相萃取柱 |
| 黄曲霉毒素固相净化柱或功能相当的固相萃取柱(以下简称净化柱):对复杂基质样品测定时使用 |
| 过滤器 |
| 一次性微孔滤头,带0.22μm微孔滤膜(所选用滤膜应采用标准溶液检验确认无吸附现象,方可使用) |
| 样品筛 |
| 筛网，1mm~2mm试验筛孔径 |
| 注射器 |
| 50mL |
| 泵 |
| 真空泵 |
| 氮气 |
| – |
| 移液管 |
| 刻度 |
| 样品瓶 |
| 进样瓶 |
| 液相色谱柱 |
| C18柱(柱长150mm或250mm,柱内径4.6mm,填料粒径5μm),或相当者 |
| 液相色谱柱 |
| C18柱(柱长100mm,柱内径2.1mm,填料粒径1.7μm),或相当者 |
| 液相色谱柱 |
| C18柱(柱长100mm或250mm,柱内径4.6mm,填料粒径5μm),或相当者 |
| 液相色谱柱 |
| C18柱(柱长100mm或250mm,柱内径4.6mm,填料粒径5μm),或相当者 |
| 液相色谱柱 |
| C18柱(柱长100mm或250mm,柱内径4.6mm,填料粒径5μm),或相当者 |
| 聚醚醚酮管 |
| PEEK管,长充50cm,内径0.5mm |
第四法 酶联免疫吸附筛查法
原理:试样中的黄曲霉毒素B1用甲醇水溶液提取,经均质、涡旋、离心(过滤)等处理获取上清液。被辣根过氧化物酶标记或固定在反应孔中的黄曲霉毒素B,与试样上清液或标准品中的黄曲霉毒素B1,竞争性结合特异性抗体。在洗涤后加入相应显色剂显色,经无机酸终止反应,于450nm或630nm波长下检测。样品中的黄曲霉毒素B1与吸光度在一定浓度范围内呈反比。
| 酶标仪 |
| 微孔板酶标仪，带450nm与630nm(可选)滤光片 |
| 研磨机 |
| – |
| 水 |
| GB/T 6682 规定二级水 |
| 振荡器 |
| – |
| 天平 |
| 电子天平,感量0.01g |
| 离心管 |
| 50 mL |
| 酶联免疫试剂盒 |
| – |
| 离心机 |
| 转速≥6000r/min |
| 滤纸 |
| 快速定量滤纸,孔径11μm |
| 样品筛 |
| 筛网，1mm~2mm孔径 |
第五法 薄层色谱法
原理:样品经提取、浓缩、薄层分离后,黄曲霉毒素B1在紫外光(波长365 nm)下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定含量.
| 甲醇 |
| CH3OH，分析纯 |
| 正己烷 |
| C6H14，分析纯 |
| 水 |
| GB/T 6682 规定的一级水 |
| 漂白粉 |
| – |
| 碳酸钠 |
| 工业用,Na2CO3·10H2O |
| 石油醚 |
| 沸程30℃~60℃或60℃~90℃ |
| 三氯甲烷 |
| CHCl3，分析纯 |
| 苯 |
| C6H6，分析纯 |
| 乙腈 |
| CH3CN，分析纯 |
| 乙醚 |
| 无水乙醚,C2H6O，分析纯 |
| 丙酮 |
| C3H6O，分析纯 |
| 硅胶 |
| 硅胶G,薄层层析用 |
| 三氟乙酸 |
| CF3COOH，分析纯 |
| 硫酸钠 |
| 无水硫酸钠,Na2SO4，分析纯 |
| 氯化钠 |
| NaCl，分析纯 |
| 冰箱 |
| 4℃ |
| 容量瓶 |
| 10 mL |
| 容量瓶 |
| 5mL |
| 锥形瓶 |
| 250 mL具塞 |
| 滤纸 |
| 快速定性滤纸 |
| 分液漏斗 |
| – |
| 黄曲霉毒素B1 |
| AFT B1，C17H12O6,CAS:1162-65-8，纯度≥98%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质 |
| 样品筛 |
| 圆孔筛，2.0mm筛孔孔径 |
| 粉碎机 |
| 小型粉碎机 |
| 振荡器 |
| 电动振荡器 |
| 蒸馏装置 |
| 全玻璃浓缩器 |
| 薄层板 |
| 玻璃板,5cm×20cm |
| 薄层板涂布器 |
| – |
| 展开缸 |
| 展开槽,长25cm,宽6cm,高4cm |
| 紫外灯 |
| 100W~125W,带365nm滤光片 |
| 注射器 |
| 微量注射器或血色素吸管 |
| 烧杯 |
| – |
| 干燥器 |
| – |
| 滤纸 |
| 定量慢速滤纸 |
| 蒸发皿 |
| 50 mL |
| 通风柜 |
| – |
| 滴管 |
| 带橡皮头 |
| 试管 |
| 2mL具塞 |
| 锥形瓶 |
| 100mL具塞 |
| 吹风机 |
| 冷风 |
| 支架 |
| 玻璃支架 |
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